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熒光定量PCR常見問題

發布時間：2017-11-29　瀏覽次數：4366

Q1：熒光信號升高太高，雜亂無章，看上去像擴增失敗，超出檢測范圍？

A1：該現象主要表現在ABI儀器系列，原因主要是ROX濃度較低，對于ABI系列，除ABI 7500和ABI 7500FAST之外，ABI系列儀器應都使用高濃度ROX染料。

Q2：高濃度模板，Ct值卻更低，甚至檢測不到？

A2：該現象是因為模板含量太高，信號出現早，與儀器基線設置不匹配的原因�？赏ㄟ^A:稀釋模板； B: 修改數據分析時的基線設置，使基線的循環數小于小于樣品的Ct值。

Q3：陰性對照有擴增，但多個陰性對照的Ct值大小不等，熔解曲線呈單峰。

A3：反應體系被污染。具體有3個可能：

A3-1：模板交叉污染：需要使用帶濾芯的吸頭；

A3-2：PCR產物氣溶膠污染：反應體系中加入UNG酶/dUTP(會增加實驗成本）；將反應體系的準備與產物跑膠在不同場所進行。

A3-3：反應體系下的其它組分被污染：換用新的組分。

Q4：陰性對照有擴增，多個陰性對照的Ct值類似，熔解曲線有多個峰

A4：有引物二聚體�？赏ㄟ^如下方法解決：

A4-1：降低引物濃度至0.1μM。

A4-2：將PCR擴增程序由兩步法改為三步法。

A4-3：重新設計引物。

Q5：熔解曲線有2個或者2個以上的峰

A5：反應特異性差；有引物二聚體或者其他非特異性擴增�？赏ㄟ^如下方法解決：

A5-1：降低引物濃度至0.1μM。

A5-2：將PCR擴增程序由兩步法改為三步法。

A5-3：重新設計引物。

Q6：ΔRn⠼font face="宋體" >不超過1，在低水平徘徊

A6-1：⠼font face="宋體" >無擴增：無模板的陰性結果、引物問題、組分加錯等原因。

A6-2：樣品中模板含量太高：稀釋模板

A6-3： C_T值出現太早：修改數據分析時的基線設置，使基線的循環數小于樣品的C_T值。

A6-4：與儀器設置不匹配。

Q7：標準曲線斜率絕對值大于4，擴增效率低于90%

A7-1：模板中含有PCR反應抑制因子，反應被抑制：將模板進行稀釋，或者重新提取RNA，或者春花cDNA。

A7-2：難擴增模板：PCR擴增階段采用三步法，延長延伸時間，調整鎂離子濃度等。

A7-3：引物問題：換用其它引物進行PCR反應，如其它引物無此問題，則說明是引物問題。改變擴增條件可能有改善，如仍無改善，需要重新設計引物。

A7-4：模板稀釋錯誤：重新稀釋模板。

Q8：標準曲線斜率絕對值小于3，擴增高于110%

A8-1：非特異性擴增：降低引物濃度；改變退火溫度；重新設計引物。

A8-2：引物二聚體：降低引物濃度，重新設計引物。

A803: 模板稀釋錯誤：重新稀釋模板。

Q9：標準曲線R²小于0.98

A9-1：標準曲線的個別點結果有誤：檢查CT值的最大點和最小點是否超過檢測范圍，只有在線性范圍內定量才是準確的。

A9-2：模板稀釋錯誤：重新稀釋模板。