核酸提取純化常見問題

A. 使用翼飛雪任何產品，都需要嚴格按照翼飛雪產品說明書進行操作。

B. DNA/RNA/蛋白提取，產物量（觀察現象）與產物純度始終是一對矛盾。

C. 提取之前，先仔細閱讀說明書，重點查閱說明書中黑體加粗的提示。

Q1：提取質粒加入B uffer 3之后，提高離心速度和離心時間，對于提取產物有何影響？

A1：加入Buffer 3之后提高立新速度和離心時間確實有利于沉淀貼壁更加緊密，但是常溫

下離心時間過長會使液體溫度升高，造成質粒降解。一般情況下可以4℃、12000rpm離心

10min，或者常溫下12000rpm離心3-4min即可。

 

Q2：瓊脂糖凝膠回收時，如回收DNA片段過短怎么樣處理？

A2: 如果回收DNA片段小于500bp時，為了提高回收效率，可以在加入凝膠液溶解凝膠

后，加入1.5倍體積凝膠塊體積的異丙醇，并充分顛倒混勻。

 

Q3: 瓊脂糖凝膠回收時，如何處理凝膠液溶膠后的顏色異常？

A3: 凝膠液完全溶膠后，正常顏色應該是淺黃色。如果顏色變為紅色或者橙色之后，需要加入5μl 5M NaAc（pH5.2）調節溶液的pH值，是混合物的顏色恢復為正常的淺黃色（如不調節pH值，會影響DNA的回收率）。

 

Q4: 基因組DNA提取的時候，如何確定裂解液體積與樣品質量的關系：

A4：理論上，裂解液的體積越大、樣品的量越少，提取產物的質量越好。因此裂解液體積與樣品質量的最佳比例應在實驗前摸索優化。如下僅為1ml裂解液能夠裂解樣品量的推薦數值，僅供參考。

動物組織：5-10mg	貼壁細胞：10cm2	懸浮細胞：5× 106數量
人血液：100-300 μl	小鼠血液：50-100 μl	植物組織：30mg
土壤：300mg	糞便：10mg	革蘭氏陰性菌：1ml
酵母、革蘭氏陽性菌、絲狀真菌：10mg
復雜樣品（食品、垃圾、植物器官、多糖多酚植物）：300mg

 

Q5: 基因組DNA提取時，采取哪些方法可以提高產物得率？

A5-1：適當加大裂解液體積與樣品質量的比例。

A5-2：洗脫液提前預熱至65℃ 左右，同時洗脫液上柱時要小心加到吸附膜的中間部位，并確保液體將膜全部覆蓋。

A5-3: 樣本裂解后的混合液上柱時如體積過大，需要分次上柱，并且確保每次上樣量不超過700μl。

A5-4：適當延長組織的勻漿和裂解時間。

 

Q6：提取產物的A260/A280比值較高的原因？

A6：純凈的DNA的A260/A280比率在1.8-2.0之間，如樣品中RNA的殘留量較多，則會造成A260/A280的比較較高，需要在提取過程中加入RNase A（如提取過程中按照說明書加入了RNase A，則要考慮RNase活性降低的可能性）。

 

Q7: 血液基因組DNA提取之前的樣本處理注意事項？

A7-1: 人血液中含有大量可能干擾下游DNA分析的酶抑制劑，另外諸如干擾素、EDTA等通用的抗凝劑還會干擾下游檢測。因此從人血液中分離DNA時，需要具備可提供不含污染物和酶抑制劑的優質DNA的方法。

A7-2： 哺乳動物的紅細胞中不含有核酸，但健康的哺乳動物血液中紅細胞含量要超過含有核酸的白細胞（包括淋巴細胞、單核白細胞、顆粒性白細胞等）近1000倍，因此在提取基因組DNA之前去除紅細胞可提高DNA產量，推薦方法如下：

A7-2-1：選擇性溶解紅細胞：在低滲緩沖液條件下，紅細胞會較早低滲休克和快速破裂。

A7-2-2：Ficoll密度梯度離心法，可回收單核細胞（淋巴細胞和單核細胞）并去除紅細胞（此方法還可去除粒細胞）。

A7-2-3：室溫下對全血進行3300g離心10min，離心后會分成三層：上清層為質粒；中間層為白細胞層；底層含有濃縮的紅細胞。

A7-3：鳥類、魚、青蛙的紅細胞含有核酸，因此不需要處理紅細胞。

A7-4: 血液樣本（包括經過紅細胞去除處理的血液樣本），可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。

A7-5：除動物基因組DNA外，也可以從血液中分離病毒和細菌DNA。

 

Q8：總RNA提取的時候，如何確定裂解液和樣本量的關系？

A8: 理論上，裂解液的體積越大、樣品的量越少，提取產物的質量越好。因此裂解液體積與樣品質量的最佳比例應在實驗前摸索優化。如下僅為1ml裂解液能夠裂解樣品量的推薦數值，僅供參考。

動物組織：50-100mg	貼壁細胞：10cm2	懸浮細胞：5× 106數量
人血液：100-300 μl	小鼠血液：50-100 μl	植物組織：50mg
土壤：300mg	糞便：10mg	革蘭氏陰性菌：1ml
酵母、革蘭氏陽性菌、絲狀真菌：10mg
復雜樣品（食品、垃圾、植物器官、多糖多酚植物）200mg

 

Q9：總RNA提取時樣本的處理方式？

A9-1：理論上越新鮮的樣本，提取的總RNA質量越好。如果不能及時提取，需要使用液氮迅速冷凍樣本，然后一直儲存于-80℃條件下。 樣本的反復凍融對于提取RNA的質量有很大的影響。

A9-2：破碎：組織結構、細胞壁和細胞質膜的徹底破碎對于釋放樣本中所有的RNA是絕對必要的。不同的樣本需要使用不同的方法以達到徹底的破碎效果。不完全的破碎會導致RNA得率的顯著降低。  

A9-3：勻漿：勻漿對于減少破碎后細胞裂解產物的粘性是十分必要的。勻漿能切斷高分子量的基因組DNA以及其它高分子量的細胞組分，得到均勻的裂解產物。勻漿不徹底會導致RNA結合效率的下降而顯著降低得率。

A9-4：不同樣本處理方法建議

樣本來源	破碎方法	勻漿方法	建議
動物培養細胞	加入裂解緩沖液	使用轉子-定子勻漿機或注射器和針頭獲取胞質RNA	如細胞數量少于1×105，可使用渦動勻漿裂解產物，不建議勻漿方案。
動物組織	轉子-定子勻漿機	轉子-定子勻漿機	同步進行破碎和勻漿
	研缽和杵	注射器和針頭	使用轉子-定子勻漿機和玻珠研磨機通常比使用研缽和杵的得率更高。
	玻珠研磨機	玻珠研磨機
細菌	加入裂解緩沖液	渦旋機	如果處理大于5×108個細胞，使用注射器和針頭進行勻漿可能會提高產率。
	玻珠研磨機	玻珠研磨機	不能使用渦動操作代替。
酵母	酶解（溶菌酶/消解酶）細胞壁后加入裂解緩沖液	渦旋機
	玻珠研磨機	玻珠研磨機	不能使用渦動操作代替。
植物和絲狀真菌	研缽和杵	注射器和針頭	研缽和杵不能代替轉子-定子勻漿機。

 

Q10：RNA提取后如何定量？

A10-1：檢測RNA樣本時，需確保比色杯中去除了RNA酶，特別是測定之后仍需回收這些RNA的情況下（操作方法可按照通過使用0.1M NaOH、1mM EDTA和不含RNase水的順序來依次洗滌）。

A10-2：使用紫外通透塑料比色杯的分光光度計時，測量A260的吸光值時，讀數應該在0.15-1.0之間，A260波長下，1個單位的吸光值對應44μg/ml的RNA濃度（這一相關性僅對中性pH值條件下的檢測有效。因此如需稀釋RNA樣品，應使用如pH7.0、10mM Tris HCl的中性pH值的低鹽緩沖液。）

A10-3：RNA定量舉例

RNA樣品體積=100μl

稀釋=10μl RNA樣品+490μl 10mM Tris HCl，pH7.0（稀釋倍數1:50）

使用1ml去RNA酶的比色杯，檢測稀釋后樣本的吸光度

A260=0.2

 

RNA濃度

=44μg/ml × A260 × 稀釋倍數

= 44μg/ml × 0.2× 50

=440μg/ml 

Q11：提取產物低

A11-1：沒有使用平衡液平衡柱膜。

 

A11-2：樣品裂解不充分：

-樣品與裂解液必需充分混勻

-增加裂解液：樣品的體積質量比

-動物組織處理前切成盡量小的小塊

 

A11-3：樣品質量不好

-樣品盡可能新鮮（如植物組織越嫩越好）

-樣品采集后如不能及時提取，需盡快-70℃或者液氮儲存

-樣品避免反復凍融

 

A11-4：離心柱堵塞

過柱前裂解液混合物應呈現清澈，如有渾濁應離心去除

 

A11-5：洗脫條件需要優化

-使用試劑盒的洗脫液進行洗脫，盡量不使用超純水洗脫

-使用超純水洗脫，必需調節值pH7.0-8.5

-洗脫液提前在65℃溫浴1-2min，對提高DNA產量極有幫助

-洗脫液要添加在柱膜中央，且全部覆蓋柱膜

 

A11-6：部分樣品需要添加蛋白酶K（如鼠尾組織）

-試劑盒中沒有此成分，如大客戶需要，可以贈送（使用方法與使用量參考其他公司）

Q12：DNA影響后續酶切反應

A12：洗脫液YWS(Wash Solution)中的乙醇有殘留

   -加入YWS離心后，再次離心的步驟切不可省略。

 

Q13：DNA降解

A13：-樣本不新鮮

   -液氮研磨時有回潮現象

 

Q14:提取基因組DNA產物A260/A280的值較高（正常比值為1.8-2.0）

A14：提取產物中RNA含量較高

   -提取過程中加入RNase A，如大客戶需要，可以贈送（使用方法與使用量參考其他公司）

 

Q15：使用質粒小提試劑盒時，加入YS3緩沖液之后，提高離心速度和離心時間之后，對于提取產物有什么影響？

A15：-加入YS3之后提高離心速度和離心時間，會有助于沉淀貼壁更為緊密，但常溫下離心時間過長會導致液體溫度升高，導致質粒降解，因此一般情況下4℃、12000rpm離心10min，或者常溫下12000rpm離心3-4min即可。

 

Q16：瓊脂糖凝膠回收時，如回收片段過短怎么處理？

A16：-任何品牌的膠回收試劑盒，對于過小或過大的DNA片段，回收效率都會降低。如回收片段過�。ǎ�500bp），可以在溶膠后加入溶膠液1.5倍體積的異丙醇，充分顛倒混勻后，進行下一步操作。

 

Q17：瓊脂糖凝膠回收時，如溶膠后溶膠液的顏色出現橙色或者紅色怎么處理？

A17：-凝膠液完全溶膠后，液體顏色應該是淺黃色。如果顏色變為橙色或者紅色，需要加入5µl 5M NaAc（pH5.2）調節溶液的pH值，使液體的顏色恢復為正常的淺黃色。

   -如不調整pH值，會對DNA的回收率有明顯的影響。